抗体开发需要多长时间?
收到第一批上清液形式的抗体(条件培养基中的分泌型抗体)通常需要三个月左右的时间,这些抗体将根据使用免疫原通过ELISA 的筛选方案以1 mL至2 mL等分的形式交付。客户将使用上清液验证抗体,并选择杂交瘤群体进行有限稀释和克隆群体扩增。一旦杂交瘤细胞株准备好,客户就可以决定是否在自己的实验室用克隆生产抗体,或者 ProMab 可以利用培养基或通过腹水进行大规模生产。
客户能得到哪些阳性克隆?
我们不可能对抗体的所有应用进行测试,但我们保证至少有 10 个阳性克隆是利用客户提供的抗原进行 ELISA 检测的。如果客户需要进行其他筛选检测,以验证抗体的特定应用,如 Western、IHC 或流式细胞术,请联系客服。
客户会收到克隆杂交瘤细胞系吗?
在每个项目结束时,我们会将亚克隆,克隆细胞系以冷冻或活培养的形式寄给您。冻存细胞系(2-3瓶,除非要求更多数量)将在液氮中保存 6 个月,不收取额外费用。如果客户要求细胞系的储存时间超过 6 个月,则需要支付象征性的额外费用。
用什么抗原制造抗体?
远泰生物(ProMab) 的免疫方案可适用于天然蛋白、重组蛋白、藕联多肽及藕联小分子。如果合成肽小于 8 kDa,则需要通过增加半胱氨酸残基的巯基与载体分子 KLH偶联。一般来说,与较大的重组蛋白或蛋白片段相比,肽抗原在引起强烈免疫反应方面的成功率较低。不过,多肽抗原的优点是可以经过精心设计,避开与同一蛋白家族其他成员相似或相同的序列区域,因此可能更具特异性。
抗体开发需要多少抗原?
如果抗原是多肽,一般需要 5 毫克游离多肽和 5 毫克共轭多肽就足够了。如果多肽高度纯化,所需用量可能更少。如果抗原是蛋白质,3-5 毫克(浓度为 0.5-1 毫克/毫升)一般就足够了。请务必告知我们使用的缓冲液和蛋白质浓度。亲和纯化抗体时,需要 5 毫克可溶性蛋白来制备免疫亲和柱。
如何检测你们开发的抗体?
根据客户的抗体应用要求,通过 ELISA、Western 、 IHC 、 ICC 对抗体进行检测。所有 ProMab 抗体都经过了广泛的测试。根据客户要求,我们还使用非传统检测方法对抗体进行检测,包括免疫沉淀和流式细胞术。
如何测量抗体滴度?
抗体滴度通过 ELISA 法测定。在这种方法中,我们在 96 孔板上涂抹抗原,然后反复清洗以去除未结合的抗原。在与抗原结合的孔中加入抗体的系列稀释液,反复清洗以去除未结合的抗体。然后加入标记的二抗,用比色法测定结合一抗的量。
如何储存抗体?
冻干抗体的储存:我们的所有产品都是冻干的。这种形式的抗体在环境温度下可长期稳定保存而不会降低质量。在 -20˚C 下可保存数年。加水复溶后,储存条件取决于抗体的类型,如下所述。
腹水: 重组腹水时,加入少量叠氮化物或硫柳汞以防止微生物生长。腹水应冷冻保存。单克隆抗体通常不会因冻融而失去明显的活性,但建议分装以避免重复冻融。不建议在 4˚C 下长期保存!与血清不同,腹水可能含有蛋白酶,最终会降解抗体。加入蛋白酶抑制剂可能有助于减缓降解。
纯化的 IgG:除非添加 BSA 等载体蛋白,否则不要储存稀释的(<0.1mg/ml)抗体溶液。IgG 和其他蛋白质一样,会与玻璃和塑料发生非特异性结合。任何低于 0.1 mg/ml 蛋白质的 IgG 溶液都会粘附在储存容器上并变性,从而失去活性。反复冻融稀释纯化的 IgG 几乎肯定会导致大量损失。
兔血清: 血清中的抗体比腹水中的抗体更稳定。使用抗微生物添加剂后,可将其储存在 4˚C 温度下(血清不含明显的蛋白酶活性;事实上,血清本身就含有强大的鸡尾酒蛋白酶抑制剂)。不过,冷冻保存的时间更长(数月至数年)。
多克隆亲和纯化抗体: 由于蛋白酶抑制剂和载体蛋白在纯化过程中被去除,纯化抗体在血清中稳定性不如腹水。因此,不建议在 4˚C 下长期保存(如数周)。
抗体的滴度和工作稀释度有什么区别?
抗体滴度是指抗体在特定系统中仍然有效的最低浓度(最高稀释度)。工作稀释度通常是指能够提供高灵敏度和高信噪比的浓度。使用过高的浓度会造成浪费,并可能产生非特异性信号。另一方面,浓度过低会导致灵敏度下降。
如何用 280nm 波长的吸光度确定抗体浓度?
抗体量可通过 280nm 波长处的吸光度确定。1 OD = 约 0.75 mg/ml 纯化抗体。
在免疫学技术中,用什么来阻断非特异性结合?
这主要取决于所用抗体的类型。对于大多数 ELISA 和 Western 应用,2% 脱脂牛奶是一种很好的阻断剂。另外,3% 牛血清白蛋白有时也很有效。明胶或血清(非一抗种类)也可用于阻断非特异性结合。
什么是单特异性反应?
单特异性抗体是指只与单一抗原决定因子发生反应的抗体。单克隆抗体是唯一真正的单特异性试剂。不过,该术语也用于描述针对肽抗原培养和亲和纯化的多克隆抗体。
线性表位与构象表位有何区别?
线性表位由蛋白质分子上可被抗体识别的约 6 到 10 个相邻氨基酸组成。相反,构象表位由不按顺序排列的氨基酸组成。在这种情况下,抗体只能识别抗原的三维结构。当蛋白质分子折叠成三维结构时,形成表位的氨基酸会并列在一起,从而使抗体能够识别序列。了解线性表位或构象表位之间的差异在免疫学应用中意义重大。在变性蛋白质中,只有线性表位可以被识别。因此,在使用变性蛋白质的方案中,如在 Western 印迹法中,首选能识别线性表位的抗体。有时,表位在蛋白质内部,相对于其原生构象而言。在非变性方案(如非变性免疫沉淀)中,抗体无法识别该表位。根据定义,构象表位必须位于折叠蛋白质的外部。能识别构象表位的抗体适用于温和的非变性程序,如非变性免疫沉淀或流式细胞仪。最理想的情况是,能识别正常折叠蛋白质表面线性表位的抗体在非变性和变性程序中都能很好地发挥作用。