MLH1抗体微卫星不稳定性(MSI)检测

微卫星不稳定性（MSI）作为肿瘤分子病理诊断中的关键指标，与肿瘤发生发展机制及临床治疗方案选择密切相关。MLH1基因编码的蛋白质是DNA错配修复系统的重要组成部分，其功能异常会导致微卫星序列不稳定积累。基于MLH1抗体的MSI检测，通过特异性识别MLH1蛋白表达状态，为MSI状态判定提供可靠依据，在临床诊断与研究领域具有重要应用价值。以下将详细阐述该检测的标准操作协议，确保检测过程规范、结果准确。

一、样本处理规范

样本处理是保障检测质量的基础环节，需严格遵循以下步骤。首先选取合适的组织样本，优先选择新鲜或甲醛固定石蜡包埋（FFPE）的肿瘤组织，样本中肿瘤细胞比例需不低于50%，以减少非肿瘤细胞对检测结果的干扰。对于FFPE样本，需进行蜡块切片，切片厚度控制在3-4μm，避免切片过厚导致染色不均或过薄造成组织丢失。切片后进行脱蜡处理，依次使用二甲苯、梯度乙醇（100%、95%、85%、75%）浸泡，每步浸泡时间5-10分钟，确保彻底去除石蜡，为后续抗原修复奠定基础。抗原修复采用柠檬酸盐缓冲液（pH6.0）高温高压修复法，修复时间10-15分钟，修复后自然冷却至室温，以恢复抗原表位活性，提高抗体结合效率。

二、实验操作步骤

实验操作需在标准实验室环境下进行，严格按照试剂说明书及操作流程执行。第一步为封闭处理，使用3%过氧化氢溶液室温孵育10分钟，以阻断内源性过氧化物酶活性，避免非特异性染色；随后用5%牛血清白蛋白（BSA）室温封闭30分钟，减少抗体非特异性结合。第二步为抗体孵育，将稀释后的MLH1一抗（按照1:100-1:200比例稀释）均匀覆盖组织切片，4℃冰箱孵育过夜，确保抗体与抗原充分结合；次日室温复温30分钟后，用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗3次，每次5分钟，去除未结合的一抗。第三步为二抗孵育，加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗，室温孵育30分钟，PBS冲洗3次，每次5分钟，去除未结合的二抗。第四步为显色反应，使用3,3'-二氨基联苯胺（DAB）显色剂室温孵育3-5分钟，显微镜下观察显色情况，待阳性信号清晰且背景无明显染色时，用蒸馏水终止显色反应。最后进行复染与封片，使用苏木素复染30秒，盐酸乙醇分化数秒，氨水返蓝后，依次经梯度乙醇脱水、二甲苯透明，中性树胶封片，完成切片制备。

三、结果判读标准

结果判读需由专业病理医师在光学显微镜下进行，以细胞核染色情况作为判断依据。阳性判定标准为：肿瘤细胞或正常对照细胞（如淋巴细胞、间质细胞）细胞核出现棕黄色染色，且染色强度明显高于背景；根据染色细胞比例，可分为强阳性（>75%细胞染色）、中度阳性（25%-75%细胞染色）、弱阳性（<25%细胞染色）。阴性判定标准为：细胞核无棕黄色染色，或染色强度与背景无明显差异。判读过程中需同时观察正常对照细胞，若正常对照细胞呈阳性，而肿瘤细胞呈阴性，提示MLH1蛋白表达缺失，需结合其他指标进一步判断MSI状态；若正常对照细胞与肿瘤细胞均呈阳性，则需结合染色强度及比例综合评估。

四、质量控制要求

质量控制贯穿检测全过程，以确保检测结果的准确性与可靠性。样本质量控制方面，需对样本采集、固定、切片过程进行严格监控，避免样本出现坏死、自溶或污染，每批样本需设置阳性对照（已知MLH1蛋白表达阳性的组织）与阴性对照（已知MLH1蛋白表达阴性的组织）。试剂质量控制方面，所有试剂需在有效期内使用，严格按照要求储存与稀释，每次实验前需对试剂进行性能验证，确保试剂活性正常。操作质量控制方面，实验人员需经过专业培训，熟悉操作流程，严格控制孵育时间、温度、试剂浓度等关键参数，避免操作误差；每批实验需至少制备2-3张重复切片，确保结果可重复。结果质量控制方面，建立双人双次判读制度，若两次判读结果不一致，需由第三方病理医师重新判读，达成共识后确定最终结果，同时做好实验记录，包括样本信息、试剂信息、操作步骤、判读结果等，确保检测过程可追溯。

MLH1抗体MSI检测协议通过规范的样本处理、严谨的实验操作、明确的结果判读及完善的质量控制，为MSI状态检测提供了标准化技术路径。该协议的严格执行，能够有效保障检测结果的准确性与可靠性，为肿瘤分子诊断、治疗方案制定及预后评估提供重要参考。