荧光定量qPCR检测注意事项

荧光定量qPCR检测是一种在PCR扩增反应体系中加入荧光基团，通过实时检测荧光信号对未知模板进行定量分析的方法。它在病原体检测、基因表达分析、遗传病诊断等多个领域有广泛应用。以下是进行该检测时需要注意的一些事项：

一、样品准备与运输

1、样品质量：提供新鲜的、尽可能多的样本材料，或者纯化好的、纯度较好的DNA/RNA。对于组织或细胞样本，应保证其代表性和完整性，避免降解和污染。

2、运输条件：样本需采用干冰运输，以确保样本在运输过程中保持稳定。

二、实验前准备

1、实验室环境：实验室应保持清洁，每天实验前开启超净工作台的紫外线灯照射15~20分钟进行消毒。

2、个人防护：在超净台前操作时，需佩戴干净的橡胶手套或一次性薄膜手套，进行RNA抽提时还需戴好口罩。

3、实验器材：取EP管、枪头等器材时需用镊子，避免用手直接接触，且使用后应及时封好包装。

四、引物设计与验证

1、设计原则：引物设计要满足常规引物设计原则，目的片段长度控制在100~300bp，跨外显子设计以避免基因组DNA的影响。

2、扩增效率检测：设计的引物需进行扩增效率检测，只有当扩增效率在90%-110%之间时，才可用于定量实验。

3、验证特异性：通过PCR扩增、测序等方法验证引物的特异性和扩增效率，避免引物二聚体的形成和非特异性扩增的发生。

五、反应体系配制与反应条件设置

1、体系配制：反应体积优先推荐20ul和50ul。配制时需在超净工作台中通风进行，每次实验都要用新的ddH₂O。同时，每次实验都需要配制无模板对照（NTC）来验证体系中是否存在污染。

2、ROX的选择：ROX可用于均一化校正仪器的光程差等，但是否需要添加ROX与仪器型号有关。如果qPCR仪有自动校正孔间差的功能，则不需要添加ROX。

3、反应条件：根据实验需求设置合适的反应条件，包括预变性、变性、退火和延伸等步骤的温度和时间。

六、实验结果分析与质量控制

1、结果分析：根据实时荧光定量PCR仪输出的数据，分析目标序列的数量和表达水平。可通过扩增曲线和熔解曲线来评估PCR扩增的特异性和效率。

2、质量控制：在实验过程中严格控制实验条件，包括样品处理、引物设计、反应液配置、反应条件等，以确保结果的准确性和可靠性。

七、其他注意事项

1、移液枪准确性：使用性能良好的移液枪，并定期对其进行校准，以确保移液的准确性。

2、预混液混合均匀性：在使用qPCR预混液前，需充分混匀预混液，以确保各组分浓度的均匀性。

远泰生物在荧光定量qPCR检测方面具有丰富的经验，其技术人员操作经验丰富，实验结果有保障，且采用进口仪器确保实验的稳定性。