蛋白质免疫印迹注意事项

蛋白质免疫印迹法（Western Blot) ）是指通过SDS-PAGE胶将不同分子量的蛋白质分离开，然后将目标蛋白转移到载体(PVDF)膜上，利用抗原抗体的特异性结合，用特异性的一抗结合目标蛋白，用HRP标记的二抗结合一抗，再加以ECL发光液显色，检测组织或者细胞内某种或者某些特异性蛋白质的表达。蛋白质免疫印迹是做蛋白质分析的一种常规技术，常用于鉴定某种蛋白，并能对蛋白进行定性和半定量分析，还可以用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA、蛋白质-RNA相互作用后续分析。

一、远泰生物蛋白质免疫印迹的优势

远泰生物在蛋白质免疫印迹领域积累了丰富的经验，为研究人员提供高质量的WB服务。其优势主要体现在以下几个方面：

专业技术人员与实验保障：远泰生物拥有一支经验丰富的技术团队，他们在WB实验的各个环节均具备精湛的操作技能。从样品制备到结果分析，每一个步骤都经过严格的质量控制，确保实验结果的可靠性和重复性。

丰富的细胞库资源：远泰拥有丰富的细胞库资源，拥有人、小鼠、大鼠、兔、猴等不同种属的细胞裂解液。这一丰富的资源为不同研究需求提供了多样化的选择，极大地便利了跨物种研究。

高性能抗体平台：远泰生物拥有强大的产品库，提供高灵敏度、高特异性的WB应用抗体。这些抗体经过严格筛选和验证，能够满足多种实验需求，确保检测结果的准确性。

二、蛋白质免疫印迹的注意事项

1、样品准备

样品类型与保存：新鲜组织样品重量需大于30mg，并通过干冰运输。细胞样品数量需达到5×10⁶以上，收集细胞沉淀后用干冰运输。样品蛋白浓度应大于1mg/ml，蛋白量大于200μg/样品。若检测磷酸化蛋白，样品需在2-3个月内进行检测，以避免磷酸化蛋白去磷酸化。

样品处理：所有涉及蛋白的操作需在冰上进行，保证蛋白原有结构。细胞裂解液制备时，需在冰上用预冷的PBS洗涤细胞，加入预冷的裂解缓冲液后，4℃放置并剧烈震荡，最后离心取上清。组织裂解液制备时，解剖目标组织需迅速，建议多次离心去除杂质。蛋白样本制备后，需通过BCA法进行蛋白浓度测定。

2、实验操作

转膜：转膜前需提前将PVDF膜浸入预冷的甲醇中5秒以激活。转膜时要注意赶走膜与胶之间的气泡。转膜材料的放置顺序需正确，一般为：阴极、海绵（湿转需要）、滤纸、胶、PVDF膜、滤纸、海绵（湿转需要）、阳极。对于小分子蛋白，电转移缓冲液中可不加SDS，保持20%的甲醇浓度。

抗体孵育：孵育一抗前需用封闭缓冲液在室温下封闭膜1小时。一抗和二抗的稀释度、作用时间和温度需经过预实验确定最佳条件。使用稀释后的偶联二抗在封闭缓冲液中室温孵育2小时。

显色：加入ECL显色液后应全程避光，否则前功尽弃。化学发光法检测的敏感度很高，实验中取胶和膜必须带一次性手套。曝光、显影和定影需在暗室中进行，X光片用完后一定要收好，避免曝光。

蛋白质免疫印迹作为一种经典的蛋白质分析技术，在生物医学研究中发挥着不可或缺的作用。在实验过程中，严格遵循样品准备、转膜、抗体孵育和显色等关键步骤的注意事项，能够有效避免常见问题，确保实验数据的准确性和重复性。