哺乳动物细胞蛋白表达流程

哺乳动物细胞蛋白表达技术是一项极为重要的研究手段，它为众多生物制品的研发与生产提供了关键支撑，其流程涵盖多个精细且关键的环节。

一、载体构建：搭建蛋白生产“蓝图”

载体是引导外源基因进入宿主细胞的重要工具。在哺乳动物细胞蛋白表达中，常用的载体有质粒载体和病毒载体（如慢病毒、腺病毒等） 。载体的设计极为精巧，需综合考量启动子、增强子、选择标记基因等多种元素。启动子就如同蛋白表达的“开关”，决定基因转录起始的频率；增强子则能强化启动子的活性，让基因转录更高效；而选择标记基因，像是筛选细胞的“信号灯”，用于识别成功导入载体的细胞。比如，常见的哺乳动物表达载体pCDNA3.1，其合理的元件布局，使得外源基因能在哺乳动物细胞中稳定表达。

二、细胞转染：外源基因的“植入”

转染是将外源基因送入宿主细胞的关键过程。脂质体介导法、电穿孔法和化学介导法等是常用的转染手段。脂质体介导法，利用脂质体与细胞膜融合的特性，将包裹其中的外源基因带入细胞，就像给细胞“送快递”；电穿孔法则通过瞬间高压脉冲，在细胞膜上形成小孔，让外源基因“趁机而入”；化学介导法借助化学试剂改变细胞膜通透性以实现基因导入。以HEK293细胞（人胚胎肾细胞）为例，因其易于培养和转染的特性，常被用于高效表达外源蛋白，选择合适的转染方法，能大幅提升HEK293细胞对目的基因的摄取和表达效率。

三、细胞筛选与培养：“选拔”高产细胞

当外源基因成功转入细胞后，需通过筛选标记基因（如抗生素抗性基因）挑选出稳定表达目的蛋白的细胞株。这一过程如同在细胞“大军”中挑选出“精英部队”。之后，优化细胞培养条件，包括培养基成分、温度、pH值等。培养基是细胞生长的“营养库”，不同细胞对营养需求各异，需精准调配。例如，针对NS0细胞（小鼠浆细胞瘤细胞系，常用于重组蛋白表达和分泌），合适的培养基及培养条件，可促使其大量分泌目的蛋白，提高蛋白产量。

四、蛋白纯化：获取纯净产物

哺乳动物细胞蛋白表达的最后一步是蛋白纯化，从细胞培养上清或裂解细胞中收集目的蛋白，并运用多种纯化技术。亲和层析利用蛋白与特定配体的特异性结合来分离蛋白，如同用“磁铁”吸引目标蛋白；离子交换层析依据蛋白所带电荷差异进行分离；凝胶过滤则根据蛋白分子大小不同实现纯化。纯化后的蛋白还需进行质量检测，如SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳）、Western blot（蛋白质免疫印迹）、质谱等方法，确保得到的蛋白纯度、结构和活性符合要求。

哺乳动物细胞蛋白表达流程的每一步都紧密相连，从载体构建规划蓝图，到细胞转染植入基因，再到筛选培养高产细胞，最后纯化获得高质量蛋白，每个环节的精准操作与优化，是确保最终能够获得高纯度、高活性蛋白产物的关键。